多肽合成的研究及应用现状
多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。到现在，人们已在人体中发现和分离出一百多种肽类，关于多肽的研究与应用，也取得了巨大的进步，引发了空前的研究热潮。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值，多肽研究成为了医学和分子生物学研究的重点对象，世界各先进国家无不拨出巨款来建立各种规模的多肽研究中心，以期在这一重要领域中取得突破性进展。现在具有生物活性的多肽已经广泛地应用在临床检测、医学研究、疾病防治和治疗等三大方面。

1，多肽合成的研究历史

多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成（SPOS），为此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。

2，多肽合成的原理与步骤

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。

2.1多肽合成基本原理：
先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。

2.2固相多肽合成的步骤：
A，树脂的选择及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的载体主要有3类：交联聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂类树脂。氨基酸的固定主要是通过保护的氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成共价键来实现。
B，氨基、羧基、侧链的保护及脱除
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去，近年来，FMOC合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法。
C，成肽反应
固相中的成肽反应一般是将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的缩合剂(如碳二亚氨)形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。
D，裂解及合成肽链的纯化
BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。 

3，固相多肽合成的应用——多肽合成仪

多肽固相合成技术的发明同时促进了多肽合成的自动化。世界上第一台真正意义上的多肽合成仪出现在1980年代初期，它是利用氮气鼓泡来对反应物进行搅拌，用计算机程序控制来实现有限度的自动合成。虽然在各项功能方面有着明显的缺陷，但是它毕竟把人从实验室里解放出来，极大地提高了工作效率。
随着多肽科学的发展，科学家也对合成仪提出了更高的要求，从而带动了合成仪的发展。目前多肽合成仪品种繁多。从合成量上分，可分为微克级的，毫克级的，克级的和公斤级的；从功能上分，可分为研究型的，小试型的，中试型的，普通生产型的和GMP生产型的；从自动化程度上分，可分为全自动的，半自动的和手动的；从通道上分，可分为单通道的和多通道的；从技术角度上分，可分为第一代的，第二代的，和第三代的；等等。
第一代多肽合成仪标志性特点是采用氮气鼓泡的搅拌原理来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但各项功能方面有着明显的缺陷，目前采用氮气鼓泡方式的第一代多肽合成仪已大部分退出了市场。

第二代多肽合成仪标志性特点是用不完全性的机械搅拌来取代氮气鼓泡，一般可分为接触式搅拌与非接触式搅拌两种。
接触式搅拌常见的搅拌方式是伸入反应器内部的螺旋桨由上部的电机带动进行快速旋转，使反应器内部的固液两相进行混合。但搅拌方式带来的不利因素如清洗障碍，合成量低，反应死角等也不容忽视，目前全世界共大多数多肽合成仪生产厂商放弃了接触式搅拌方法。
机械性非接触式搅拌的主要原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。这种由反应器本身的运动而带动里面固液两相混合的方法克服了接触式搅拌带来的缺点，合成产量和纯度也明显好于用氮气鼓泡的第一代合成仪。所以机械性非接触式搅拌成为了多肽合成仪的主流。但是由于这种搅拌方法不能真正消除反应死角，所以科学家们并没有满足而停下他们追求完美的脚步。
 
第三代多肽合成仪其反应器转动方式有别于前两代的多肽合成仪，即反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的最上方，真正做到了无死角。无死角多肽合成仪的另一种方式是反应器在数控马达的带动下作上下180度的翻转运动。固相和液相在运动过程中不断从反应器的一端到达另一端再返回来。一般用这种仪器合成出来的肽纯度是最高的，且适合于扩大生产。
 
随着多肽药物科研和生产的不断升温，市场对仪器的需求还会持续增长，现在全世界已有十几家公司专门从事多肽合成的研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。其中，多肽合成仪的商业化开发相对成熟，美国的CEM公司是世界上非常有影响的多肽合成仪提供商，它开发的Liberty研究级微波多肽合成仪，能一次性合成长达111个氨基酸的多肽，创造单次合成多肽的最长记录，是目前市场占有率增长速度最快的研究级全自动多肽合成仪，并被美国Brookhaven国家实验室以及安进公司应用于SARS和艾滋病的药物研究。此外，美国的PTI公司已经发展成为集多肽合成仪制造、多肽合成试剂生产、以及其它相关产品研发及技术支持的大公司，其产品线囊括了多通道，生产型等各个层次满足科研用户及企业的需求；美国PSI公司首次研制出世界上第一台拥有独立知识产权的、完全符合美国FDA认证要求的大规模全自动多肽合成仪，建立了在本领域内的领先地位，PSI的6大系列多肽合成仪能全面满足各类用户的多种需求，并可根据客户需求量身订制合成仪；美国ABI公司前两年推出的433系列全自动多肽合成仪，为学者和机构提供了针对的服务良好的技术支持；美国CS Bio公司开发了各种规模的全系列多肽合成仪，经过数十年的发展，已经成为全球性多肽合成仪生产商，公司产品遍布全球，由于其优良的产品性能和良好的用户口碑，CS Bio合成仪在中国的市场份额相当可观；美国AAPPTEC公司成立于2005年3月，公司的前身是ACT（Advanced ChemTech）公司的仪器部，近年来，AAPPTEC公司在全自动多肽合成仪领域，针对不同的需求研发出数十种类型的仪器，加上长期实际应用验证的可靠性，这些仪器均可满足不同客户的不同需求，而且使用起来都相当便利。
 
4，固相多肽合成的前景
 
固相多肽合成已经有近50年的历史了，其技术亦比较成熟,多肽合成技术不断完善,从小规模、短肽链合成发展到大规模、长肽链的合成。化学多肽制备蛋白质与从纯化蛋白质开始制备抗体比较，不仅省时省事省钱，而且特异性高。通常从蛋白质序列中选择、合成多肽到制备出抗体，只需2-3个月，而从基因表达、蛋白质纯化到抗体产生至少需要2-3年，而且蛋白质家族成员和种间的特异性不能保证。例如，2003 年上市的抗爱滋病药物T-20就是一个全合成的36个氨基酸残基组成的小肽药物。上世纪90年代,组合化学与多肽合成技术相结合后,又出现了组合肽库的合成,对化学、生化、医药、分子生物学等领域起到了巨大的推动作用，随着蛋白质组学的研究深入，在多肽研究发展过程中,对保护氨基酸的要求也不断提高,使之不断改进，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。至今，人们的要求已经从合成一些较短的肽链，延伸到了能否利用从生物体合蛋白质的原理，研究合成出人们理想的任意肽段，这也是今后多肽合成的发展趋势。